Tytuł oryginału

NEANDERTHAL MAN

IN SEARCH OF LOST GENOMES

Copyright © 2014 by Svante Pääbo

All rights reserved

Projekt okładki

Prószyński Media

Grafika komputerowa na okładce

© Indigo Images

Redaktor serii

Adrian Markowski

Redakcja

Aneta Kanabrodzka

Korekta

Grażyna Nawrocka

ISBN 978-83-8069-778-2

Warszawa 2015

Wydawca

Prószyński Media Sp. z o.o.

02-697 Warszawa, ul. Rzymowskiego 28

www.proszynski.pl

Lindzie, Rune i Frei

Przedmowa

Pomysł, by napisać tę książkę, podsunął mi John Brockman. Bez jego zachęty i wsparcia nigdy nie porwałbym się na przygotowanie czegoś dłuższego niż przeciętny artykuł naukowy. Muszę jednak przyznać, że już po rozpoczęciu pracy poczułem, iż sprawia mi ona przyjemność. John, to dzięki Tobie!

Chcę też podziękować wszystkim, którzy zadali sobie trud przeczytania brudnopisu i pomogli mi swoimi uwagami w opracowaniu ostatecznej wersji tej opowieści. W pierwszej kolejności pragnę wyrazić wdzięczność mojej żonie, Lindzie Vigilant, za jej nieustające wsparcie, chociaż pracując nad książką, miałem mniej czasu dla rodziny. Szczerze doceniam pomoc znakomitych redaktorów i pracowników wydawnictwa Basic Books, między innymi Sarah Lippincot, Carol Rowney, Christine Arden, a przede wszystkim – Toma Kellehera. Mam nadzieję, że dzięki nim sporo się nauczyłem. Jestem też wdzięczny Carlowi Hannestadowi, Kerstin Lexander i Violi Mittag za ich cenne sugestie. Osobne podziękowania kieruję do Soukena Danjo, który pomógł mi się na trochę odizolować od współczesnego świata i złapać chwilę oddechu w Saikouji.

Wszystkie wydarzenia w książce przedstawiam tak, jak je zapamiętałem, nie mam jednak wątpliwości, że coś tu i ówdzie mogłem przekręcić albo dwie sprawy połączyć w jedną, zwłaszcza gdy dotyczyło to spotkań i rozmów, między innymi wizyty w Berlinie czy siedzibie 454 Life Sciences. Siłą rzeczy niektóre zdarzenia opisuję subiektywnie, choć zawsze starałem się też pokazać opinię drugiej strony, bo mam pełną świadomość, że na pewne sprawy można spojrzeć z perspektywy innej niż moja. Na koniec pragnę przeprosić wszystkich, o których nie wspomniałem w tekście, choć na to zasługują, zależało mi jednak, by lektury nie zakłócało zbyt wiele nazwisk i odniesień.

Rozdział 1

Neandertalczyk ex machina

Było to w roku 1996. Telefon zadzwonił późnym wieczorem, gdy już zasypiałem. W słuchawce usłyszałem Matthiasa Kringsa, doktoranta z mojego laboratorium w Instytucie Zoologicznym uniwersytetu monachijskiego. Powiedział tylko trzy słowa: „To nie człowiek”.

„Zaraz będę”, wymamrotałem. Narzuciłem coś na siebie i pojechałem na drugi koniec miasta. Wcześniej tego samego dnia Matthias uruchomił sekwenatory DNA i rozpoczął odczytywanie materiału genetycznego, który wcześniej wyizolował (a później namnożył) z kawałka kości ręki neandertalczyka, otrzymanej z Muzeum Regionu Nadreńskiego w Bonn. Lata doświadczeń nauczyły mnie tonować oczekiwania – mogło to być DNA bakteryjne lub ludzkie, które zanieczyściło wiekową kość; przez blisko 140 lat od jej wykopania było po temu wiele okazji. W głosie Matthiasa wyraźnie jednak pobrzmiewało podniecenie. Czyżby naprawdę udało mu się pozyskać materiał genetyczny wymarłego 30 tys. lat temu neandertalczyka, bliskiego krewnego – a może nawet przodka – człowieka współczesnego? Wydawało się to raczej mało prawdopodobne.

W laboratorium zastałem Matthiasa i Ralfa Schmitza, młodego archeologa, który pomógł nam uzyskać pozwolenie na wycięcie kawałka kości ręki ze sfosylizowanych szczątków neandertalczyka przechowywanych w bońskim muzeum. Obaj z trudem powściągali radość, pokazując mi odczytane przez sekwenator kombinacje liter „A”, „C”, „G” i „T”. Sekwencja nie przypominała żadnej z dotychczas nam znanych.

To, co dla niewprawnego oka wydaje się zupełnie przypadkowym ciągiem czterech nieregularnie powtarzających się liter, jest w istocie skróconym zapisem chemicznej struktury DNA, materiału genetycznego obecnego niemal w każdej komórce naszego ciała.

Nici podwójnej helisy składają się z cegiełek nazywanych nukleotydami: adeniny (A), tyminy (T), guaniny (G) i cytozyny (C). W kolejności ich występowania w łańcuchu, czyli sekwencji, jest zakodowana informacja genetyczna niezbędna do rozwoju i funkcjonowania każdego żywego organizmu. Fragment DNA, który tak nas zainteresował, pochodził z DNA mitochondrialnego (w skrócie mtDNA), które matka przekazuje swoim dzieciom wraz z mitochondriami komórki jajowej, a to znaczy, że jest ono dziedziczone tylko w linii żeńskiej. Niektóre rodzaje komórek zawierają nawet kilkaset takich cząsteczek. Na ich matrycy powstają białka zaangażowane w produkcję energii, co jest podstawową funkcją mitochondriów. Mitochondrialne DNA stanowi zaledwie 0,0005 procent całego naszego genomu, ale ponieważ występuje w wielu kopiach, jego pozyskiwanie i analizy są stosunkowo proste. Oczywiście większa jest też szansa, że w kościach sprzed tysięcy lat przetrwa właśnie mtDNA, a nie pozostała, chromosomalna część genomu przechowywana w jądrze komórkowym zaledwie w dwóch kopiach (od matki i ojca). Do 1996 roku odczytano tysiące sekwencji mtDNA pochodzącego od ludzi z różnych stron świata. Zwykle wszystkie nowo odczytane odcinki porównuje się z sekwencją referencyjną, pierwszą, którą udało się poznać, będącą stałym punktem odniesienia. Porównania te pozwalają określić, jakie różnice i w których miejscach ciągu liter występują najczęściej. Co niezwykłe, w odczytanej właśnie sekwencji mtDNA z kości neandertalczyka występowały różnice niepodobne do żadnych z tysięcy dotychczas poznanych w obrębie ludzkiej populacji. Trudno było w to uwierzyć.

Niemal natychmiast – zresztą jak zawsze, kiedy mam do czynienia z wyjątkowo ekscytującym lub niespodziewanym wynikiem doświadczenia – opadły mnie wątpliwości. Zacząłem szukać dziury w całym; zastanawiać się, gdzie mogliśmy popełnić błąd. A jeśli ktoś w muzeum użył podczas prac konserwacyjnych kleju na bazie żelatyny? Czy w takim wypadku wykrylibyśmy bydlęce mtDNA? Natychmiast to sprawdziliśmy, bo na szczęście ktoś już je kiedyś zsekwencjonował, ale wynik badania wykluczył taką możliwość. Nowa sekwencja była zdecydowanie podobniejsza do ludzkiej, niemniej wciąż znacząco od niej odbiegała. Wyglądało na to, że pochodzi od człowieka, lecz innego od wszystkich ludzi żyjących dziś na Ziemi. Powoli do mnie docierało, że mamy przed sobą pierwszy odczytany fragment DNA wymarłego gatunku.

Otworzyliśmy szampana, od dawna przechowywanego w lodówce w pokoju socjalnym na specjalną okazję. Świetnie zdawaliśmy sobie sprawę, że jeśli naprawdę zsekwencjonowaliśmy DNA neandertalczyka, to stoimy u progu wielkiej naukowej przygody. Czy to możliwe, że pewnego dnia będziemy porównywać geny między przedstawicielami tego gatunku a ludźmi współczesnymi? Wieczorem nieco przesadziłem z szampanem, więc wracałem ulicami uśpionego Monachium na piechotę. Wciąż trudno mi było uwierzyć w to, co się wydarzyło. Długo nie mogłem zasnąć; myślałem o neandertalczykach i o tym wyjątkowym osobniku, którego mtDNA trafiło w nasze ręce.

W 1856 roku, na trzy lata przed ukazaniem się O powstawaniu gatunków Karola Darwina, robotnicy pracujący w niewielkiej jaskini w kamieniołomie niedaleko Doliny Neandra, 11 km na wschód od Düsseldorfu, natknęli się na górną część czaszki i kilka kości należących, jak im się wydawało, do niedźwiedzia. Po kilku latach okazało się jednak, że są to szczątki wymarłego gatunku człowieka, być może nawet naszego bezpośredniego przodka. Znalezisko – wówczas pierwsze tego rodzaju – wstrząsnęło światem przyrodników. Wszyscy chcieli się dowiedzieć, kim byli neandertalczycy, dlaczego wyginęli około 30 tys. lat temu, a także jak układały się ich stosunki z naszymi przodkami, skoro jedni i drudzy żyli obok siebie w Europie przez tysiące lat (ilustracja 1.1). Podczas badań odkryto między innymi intrygujące podobieństwa między zachowaniami naszymi i neandertalczyków, którzy opiekowali się rannymi, urządzali rytualne pogrzeby, a może nawet tworzyli muzykę. Pod wieloma względami przypominali nas dużo bardziej niż małpy. Jak bliskie było to podobieństwo? Czy neandertalczycy potrafili mówić? Czy stanowili ślepą odnogę ewolucyjnego drzewa homininów, czy też może niektóre ich geny przetrwały w naszym genomie? Wszystkie te zagadnienia znalazły się w obszarze badań paleoantropologii, dyscypliny, która narodziła się w chwili odkrycia pierwszych kości w Dolinie Neandra. Tych samych, z których właśnie pozyskaliśmy informację genetyczną i ją odczytaliśmy.

Ilustracja 1.1. Zrekonstruowane szkielety neandertalczyka (po lewej) i człowieka współczesnego (po prawej). Prawa autorskie: Ken Mowbray, Blaine Maley, Ian Tattersall, Gary Sawyer, Amerykańskie Muzeum Historii Naturalnej.

Poszukiwanie odpowiedzi na powyższe pytania było fascynujące, ale badania fragmentu kości neandertalczyka mogły nam pomóc wyjaśnić jeszcze ciekawszą zagadkę. Neandertalczycy to najbliżsi krewni człowieka współczesnego, zatem było niemal pewne, że ich geny okażą się podobne do naszych. Kilka lat wcześniej mój zespół zsekwencjonował sporą liczbę fragmentów genomu szympansa i okazało się, że różnice między odpowiadającymi sobie sekwencjami w obu genomach – szympansim i ludzkim – dotyczą zaledwie ponad procentu nukleotydów. Różnica między nami a neandertalczykami była zapewne jeszcze mniejsza, ale to jednak właśnie w jej obrębie skrywały się zmiany decydujące o oddzieleniu się naszej linii ewolucyjnej od linii naszych krewnych. Nie tylko od neandertalczyków, lecz także od przedstawicieli grup, do których należeli chłopiec z Turkany (1,6 mln lat temu), Lucy (3,2 mln lat temu) czy człowiek pekiński (0,5 mln lat temu). To właśnie dzięki tej niewielkiej genetycznej odmienności zaczęliśmy się porozumiewać za pomocą mowy, stworzyliśmy kulturę i technikę, potrafimy tworzyć i doceniać sztukę. Badanie neandertalskiego DNA mogło pomóc w ustaleniu, co właściwie uczyniło nas ludźmi. Świtało już, gdy pogrążony w słodkich marzeniach, może nawet ocierających się o megalomanię, zapadłem w sen.

Nazajutrz pojawiłem się w laboratorium późno, podobnie jak Matthias. Po kolejnym przejrzeniu sekwencji i upewnieniu się, że jednak nie zaszła żadna pomyłka, zaczęliśmy się zastanawiać, co dalej. Odczytanie krótkiego kawałka mtDNA ze szczątków neandertalczyka to jedno, a przekonanie samych siebie, nie mówiąc o reszcie świata, że to mtDNA naprawdę pochodziło od osobnika, który żył – w tym konkretnym przypadku – blisko 40 tys. lat temu, to drugie. Dzięki doświadczeniu, którego nabyłem przez ostatnich 12 lat, wiedziałem, co należy teraz zrobić. Po pierwsze, konieczne było powtórzenie eksperymentu – nie jego ostatniej fazy, lecz całego doświadczenia, począwszy od zdobycia nowego kawałka kości. Było to niezbędne, by wykazać, że otrzymana przez nas sekwencja nie pochodziła na przykład z uszkodzonego i chemicznie zmienionego współczesnego mtDNA, które zanieczyściło próbkę. Po drugie, powinniśmy odczytać dłuższy odcinek sekwencji, a najlepiej zidentyfikować fragmenty nachodzące na ten już odczytany. Wydłużenie odczytanego odcinka pozwoliłoby dokładniej ustalić, na ile sekwencja neandertalskiego mtDNA różni się od ludzkiej. No i było jeszcze „po trzecie”. Zawsze zgadzałem się ze zdaniem, że nadzwyczajne twierdzenia wymagają nadzwyczajnych dowodów. W przypadku badań nad DNA pochodzącym z bardzo starych kości za taki właśnie nadzwyczajny dowód uważałem przeprowadzenie eksperymentu i potwierdzenie wyników w innym laboratorium – choć w dość konkurencyjnym świecie naukowym na ogół się tego nie praktykuje. Byłem przekonany, że tylko uzyskanie takich samych rezultatów przez niezależną od nas grupę badawczą da nam pewność, że nie doszło do zanieczyszczenia ani do żadnego błędu w metodyce. Jednocześnie zgadzałem się z Ralfem i Matthiasem, że dopóki nie będziemy w pełni przekonani, że nasze wyniki są prawidłowe, dopóty należy zachować absolutną dyskrecję.

Matthias z nową energią zabrał się do pracy, co mnie specjalnie nie dziwiło, ponieważ trzy poprzednie lata spędził na bezowocnych w dużej mierze próbach pozyskania DNA z egipskich mumii. Ralf natomiast niezbyt cieszył się z powrotu do Bonn, gdzie mógł tylko czekać z założonymi rękami na wiadomość od nas. Ja sam próbowałem zająć się inną pracą, ale trudno było mi się skupić, gdy mój kolega zajmował się potwierdzaniem otrzymanych poprzedniej nocy wyników.

Wbrew pozorom było to dość skomplikowane. W końcu nie mieliśmy do czynienia ze świeżym i nieuszkodzonym DNA pozyskanym z próbki krwi honorowego krwiodawcy. Elegancka, uporządkowana helikalna cząsteczka DNA, taka, jak się ją przedstawia w podręcznikach, czyli składająca się z dwóch podążających naprzeciw siebie łańcuchów zbudowanych z reszt cukrowych i fosforanowych, zespolonych komplementarnymi parami nukleotydów (adeniny z tyminą, guaniny z cytozyną) jest bardziej wyobrażeniem niż odzwierciedleniem rzeczywistości. Tak naprawdę obecne w jądrze komórkowym i mitochondriach DNA nie jest statyczną konstrukcją, lecz związkiem chemicznym stale wchodzącym w interakcje z otoczeniem. Cały czas pojawiają się w nim uszkodzenia, usuwane na bieżąco dzięki wyspecjalizowanej i złożonej komórkowej maszynerii. Na dodatek jest bardzo, ale to bardzo długie. Każdy z naszych 23 chromosomów to pojedyncza, gigantyczna cząsteczka DNA. Haploidalny genom człowieka składa się z 3,2 mld par nukleotydów, a ponieważ w jądrze komórkowym znajdują się dwie jego kopie, czyli 46 chromosomów (jeden z pary pochodzi od ojca, a drugi od matki), w istocie liczy sobie 6,4 mld par nukleotydów. W porównaniu z tymi olbrzymimi cząsteczkami mitochondrialne DNA jest maleńkie, zawiera zaledwie 16 500 par zasad. Wprawdzie występuje w wielu kopiach, ale to wyizolowane z kości z pewnością było mocno zanieczyszczone i pofragmentowane.

Najczęstszym uszkodzeniem DNA, czy to mitochondrialnego, czy jądrowego, jest utrata grupy aminowej z cytozyny (C), zmieniająca ją w „nienaturalny” nukleotyd – uracyl (U). Oczywiście w komórce działają odpowiednie enzymatyczne systemy naprawcze usuwające uracyl i zastępujące go właściwym nukleotydem, cytozyną. Wycięte cząsteczki uracylu trafiają następnie do komórkowego śmietnika. Na podstawie badań uszkodzonych nukleotydów wydalanych z organizmu wraz z moczem naukowcy ustalili, że codziennie w każdej komórce ciała około 10 tys. razy cytozyna zmienia się w uracyl, co następnie jest korygowane. A to tylko jeden z przykładów chemicznych zagrożeń czyhających na nasz genom. Innym jest utrata nukleotydu. Powstająca wtedy szczerba mogłaby doprowadzić do przerwania helisy, ale zapobiegają temu enzymy, które uzupełniają podobne luki. Jeśli jednak mimo wszystko dojdzie do pęknięcia nici, inne wyspecjalizowane białka szybko połączą uszkodzone końce. Gdyby wszystkie te zabezpieczenia nie działały jak należy, cząsteczka DNA nie utrzymałaby się w komórce w jednym kawałku nawet przez godzinę.

Rzecz jasna systemy naprawcze wymagają do działania energii. Gdy umieramy, przestajemy oddychać, a wtedy w komórkach kończy się tlen i wytwarzanie energii ustaje. Przestają wówczas działać procesy naprawcze DNA i natychmiast zaczynają się w nim gromadzić uszkodzenia, do czego dochodzą jeszcze procesy rozkładu. W żywej komórce różne jej części są od siebie odizolowane. W niektórych przedziałach („kompartmentach”, jak mawiają biolodzy) znajdują się enzymy zdolne do przecinania nici DNA (zwykle potrzebne do jej naprawy), w innych są przechowywane enzymy rozkładające kwasy nukleinowe mikroorganizmów próbujących zainfekować komórkę. Po śmierci wszystkie bariery między komórkowymi kompartmentami rozpadają się, a uwolnione enzymy zaczynają rozkładać DNA. W ciągu godzin i dni nici DNA są cięte na coraz krótsze i krótsze kawałeczki, a przy tym akumulują liczne uszkodzenia chemiczne. W tym samym czasie bakterie bytujące w jelitach i płucach, niepowstrzymywane dotychczasowymi ograniczeniami, zaczynają szybko się mnożyć. Wszystkie te procesy niszczą stopniowo informację genetyczną, która najpierw służyła do kierowania rozwojem, a potem funkcjonowaniem ciała. Kiedy wymienione wyżej destrukcyjne procesy się kończą, znikają ostatnie ślady naszej biologicznej unikatowości. W pewnym sensie dopiero wtedy dopełnia się fizyczna śmierć.

Warto jednak pamiętać, że każda z bilionów ludzkich komórek zawiera komplet informacji genetycznej, zatem jeżeli w jakiejś części rozkładającego się ciała nie dojdzie do pełnej degradacji komórek i DNA, wówczas przetrwa przynajmniej fragment genetycznego dziedzictwa. Weźmy na przykład enzymatyczne procesy rozkładu DNA – większość z nich przebiega tylko w obecności wody. Jeśli jakaś część ciała wyschnie wystarczająco szybko, to fragmenty DNA mogą przetrwać całkiem długo. Tak dzieje się na przykład podczas mumifikacji, bez względu na to, czy dochodzi do niej naturalnie, czy też ciało jest konserwowane w ten sposób intencjonalnie. Jak wiadomo, tego rodzaju zabiegi przeprowadzano w starożytnym Egipcie z powodów religijnych, w celu stworzenia schronienia dla duszy. W okresie 5–1,5 tys. lat temu praktyce tej poddano ciała setek tysięcy zmarłych.

Niektóre części ciała, na przykład kości i zęby, nawet bez mumifikacji mogą przetrwać całkiem długo. W tych twardych tkankach znajdują się zagnieżdżone w mikroskopijnie małych jamkach komórki odpowiedzialne między innymi za formowanie się nowej kości, gdy dojdzie do pęknięcia lub złamania. Kiedy komórki te giną, ich DNA może się z nich wydostać, a następnie związać z niektórymi mineralnymi składnikami kości, co w niektórych przypadkach może uchronić kwas nukleinowy przed strawieniem przez enzymy. W ten sposób, przy dużej dozie szczęścia, DNA może przetrwać komórkowe procesy degradacyjne następujące bezpośrednio po śmierci.

Czas jednak dalej robi swoje i rozkład, choć znacznie wolniej, wciąż postępuje, na przykład wskutek docierającego do Ziemi promieniowania kosmicznego, które powoduje powstawanie reaktywnych cząsteczek uszkadzających czy nawet rozrywających łańcuch DNA. Nie ustają także procesy chemiczne wymagające wody, jak choćby wspomniana deaminacja cytozyny do uracylu, nawet jeśli DNA znajduje się w relatywnie suchych warunkach. Ma ono duże powinowactwo chemiczne z wodą (jej cząsteczki znajdują się w bruzdach helisy), a zatem niektóre reakcje zależne od wody wciąż zachodzą, choć powoli. Utrata grupy aminowej (deaminacja) cytozyny jest jednym z najszybszych tego typu procesów i do tego stopnia destabilizuje nici DNA, że w końcu pękają. Takie i podobne reakcje, z których wiele wciąż słabo poznano, z czasem „zjadają” DNA, któremu udało się przetrwać bezpośrednie katastrofalne następstwa śmierci komórki. Chociaż szybkość niszczenia DNA zależy od wielu czynników, między innymi od temperatury czy kwasowości środowiska, to nawet w warunkach sprzyjających konserwacji rozkład kiedyś dobiega końca. Znikają wtedy ostatnie strzępy informacji o danej osobie. W tym wypadku wyglądało jednak na to, że mimo upływu 40 tys. lat, w badanej przez nas kości neandertalczyka procesy rozkładu jeszcze się nie zakończyły.

Matthias odczytał sekwencję mtDNA długości zaledwie 61 nukleotydów. Żeby to zrobić, musiał najpierw wielokrotnie powielić wyjściowy fragment DNA, co wymagało wykorzystania techniki łańcuchowej reakcji polimerazy, nazywanej PCR1. Powtarzając eksperyment, musiał zatem zacząć od ponownego przeprowadzenia PCR. Polegało to na wykorzystaniu dwóch krótkich, zsyntetyzowanych wcześniej fragmentów DNA nazywanych starterami (primerami), o sekwencji komplementarnej (umożliwiającej sparowanie się nukleotydów) do fragmentu matrycowego DNA z kości. Miejsca, do których miały się przyłączyć startery, dzieliło 61 nukleotydów. Matthias dodał startery do mieszaniny reakcyjnej, w której znajdowała się też maleńka ilość DNA pozyskanego z kości oraz enzym o nazwie polimeraza DNA, syntetyzujący nową nić, począwszy od przyłączonego startera. Taką mieszaninę podgrzewa się, wskutek czego obie nici tworzące helisę oddzielają się od siebie, po czym się ją ochładza. W tym czasie do rozdzielonych nici przyłączają się startery (na zasadzie komplementarności sekwencji A łączy się z T drugiej nici, a G z C). Ponownie zmienia się temperaturę, by była odpowiednia dla polimerazy DNA, która wydłuża drugą nić, zaczynając od początkowego, dwuniciowego już odcinka tworzonego przez starter przyłączony do nici matrycowego DNA. Następnie cały cykl się powtarza. Po pierwszym cyklu na matrycy dwóch rozdzielonych nici fragmentu DNA pozyskanej z kości powstają ich identyczne kopie, a więc nici są cztery, bo obie pochodzące z oryginalnej helisy zostają zduplikowane. W kolejnym cyklu jest ich już osiem, następnie 16, 32 i tak dalej – łącznie przez 40 cykli.

Genialną w swojej prostocie technikę PCR opracował w 1983 roku naukowiec i ekscentryk Kary Mullis. Ma ona niezwykłą moc – po 40 cyklach na matrycy pojedynczego fragmentu DNA możemy uzyskać nawet bilion jego kopii! Tylko dzięki niej nasza praca ze starożytnym DNA2 była w ogóle możliwa. Kary Mullis naprawdę zasłużył na Nagrodę Nobla z chemii, którą otrzymał w 1993 roku. Nadzwyczajna czułość PCR bywa też jednak problemem. W ekstrakcie z kości neandertalczyka w najlepszym wypadku mogły się znajdować tylko nieliczne fragmenty jego materiału genetycznego. Równocześnie istniało spore ryzyko zanieczyszczenia tego roztworu molekułami współczesnego pochodzenia. Śladowa ilość współczesnego ludzkiego DNA może się łatwo dostać do mieszaniny razem z reagentami, zanieczyszczeniami na powierzchni plastikowych probówek i naczyń, końcówek pipet automatycznych czy nawet z fruwającego w powietrzu kurzu. Kurz w pomieszczeniach, w których przebywają ludzie, to w dużej mierze fragmenty złuszczonego naskórka, z komórkami wciąż zawierającymi sporo DNA. Poza tym ludzkie DNA mogło zanieczyścić próbkę wcześniej – czy to w muzeum, czy nawet jeszcze podczas wykopalisk. Planując eksperyment, byliśmy świadomi wszystkich tych zagrożeń i dlatego właśnie wybraliśmy do sekwencjonowania przypuszczalnie najbardziej zmienny fragment neandertalskiego mtDNA. Wiedzieliśmy, że w tej części sekwencji występuje najwięcej różnic w obrębie współczesnej ludzkiej populacji, dlatego mieliśmy nadzieję, że uda nam się przynajmniej określić, czy badamy próbkę pochodzącą od jednej osoby, czy raczej jest ona zanieczyszczona DNA kilku osób. To właśnie dlatego tak nas ucieszyło odkrycie, że odczytany ciąg zawiera nieznane dotąd zmiany w niektórych nukleotydach. Gdyby bardziej przypominał zapis mtDNA współcześnie żyjących ludzi, nie moglibyśmy rozstrzygnąć, czy to dlatego, że mtDNA neandertalczyka niewiele się różniło od naszego, czy może wpatrujemy się w sekwencję człowieka współczesnego, gdyż jakiś fragment jego DNA dostał się do naszej mieszaniny, na przykład z cząstką kurzu z powietrza.

Miałem wcześniej sporo okazji, by się przekonać, jak łatwo zanieczyścić próbki podczas eksperymentów. Przez 12 lat zajmowałem się głównie izolacją i badaniem starożytnego DNA mamutów, niedźwiedzi jaskiniowych czy leniwców naziemnych i wykrywałem ludzkie DNA niemal we wszystkich próbkach przygotowanych z kości wymarłych zwierząt, a następnie poddawanych PCR. Po wielu frustrujących porażkach opracowałem wreszcie zestaw praktyk laboratoryjnych służących zminimalizowaniu ryzyka zanieczyszczenia. I tak, Matthias przeprowadzał izolację materiału genetycznego, a także wszystkie inne czynności przygotowawcze do PCR w niewielkim pomieszczeniu odizolowanym od reszty laboratorium i pedantycznie utrzymywanym w czystości. Kiedy z matrycowego, starożytnego DNA, starterów i innych składników powstała już mieszanina reakcyjna, probówka była szczelnie zamykana i dopiero wtedy trafiała do „brudnej” części laboratorium. W „czystym” pokoju wszystkie powierzchnie raz na tydzień przemywaliśmy wybielaczem3, a każdej nocy naświetlaliśmy lampą UV, by zniszczyć ewentualne DNA fruwające w powietrzu wraz z kurzem. Do „czystego” pokoju można się było dostać jedynie przez przedsionek, w którym Matthias i inni laboranci przywdziewali strój roboczy: fartuchy, maski ochronne na twarz, siatki na włosy i sterylne rękawice. Wszystkie potrzebne chemiczne reagenty i nowe wyposażenie wędrowały bezpośrednio do tego laboratorium i nic z innych części instytutu nie miało tam prawa trafić. Matthias, a także jego koledzy i koleżanki zaczynali swoją pracę właśnie w tym pomieszczeniu. Jeśli opuścili „czysty” pokój i znaleźli się w głównym laboratorium, gdzie są prowadzone badania nad różnym DNA, do końca dnia nie mieli już wstępu do „świątyni”. Ujmując to dość delikatnie, miałem lekką, ale ze wszech miar uzasadnioną obsesję na tym punkcie.

Mimo wszystkich wymienionych środków ostrożności, zanieczyszczenia współczesnym DNA i tak się zdarzały, czego dowody zyskaliśmy zaraz po rozpoczęciu przez Matthiasa doświadczeń. Po namnożeniu za pomocą PCR fragmentu na matrycy mtDNA z kości sklonował otrzymane kopie (teoretycznie takie same) poprzez wprowadzenie ich do bakterii. Zrobił to przede wszystkim po to, by sprawdzić, czy wśród namnożonych odcinków DNA wszystkie powstały na tej samej matrycy, czy może matryc było więcej. Pojedyncza bakteria przyjmowała tylko jedną cząsteczkę DNA liczącą 61 nukleotydów, wstawioną w plazmid (kolista cząsteczka pozachromosomowego DNA występująca w cytoplazmie komórki, zdolna do autonomicznej replikacji), a następnie – po kilkunastu podziałach – dawała początek widocznej już gołym okiem kolonii, w której wszystkie bakterie zawierały przyjęty na początku plazmid. Sekwencjonując poszczególne klony bakteryjne, mogliśmy się przekonać, czy pojedyncze fragmenty DNA przyjęte przez bakterie wraz z plazmidem rzeczywiście są identyczne. W najwcześniejszym doświadczeniu Matthiasa 17 klonów miało taką samą wstawkę DNA w plazmidzie (tę różniącą się od ponad 2 tys. znanych sekwencji współczesnego ludzkiego mtDNA), ale jeden zawierał współczesną. Prawdopodobnie doszło kiedyś do zanieczyszczenia samej kości, która przez 140 lat od jej wykopania przeszła przez wiele rąk.

Matthias powtórzył PCR i wprowadził wstawki do plazmidu bakteryjnego. Tym razem uzyskał 10 klonów bakteryjnych z unikatową sekwencją i dwa ze współczesnym DNA. Gdy wyizolował DNA z kolejnego kawałka kości, a potem ponownie przeprowadził PCR oraz klonowanie, otrzymał 10 klonów z potencjalną sekwencją neandertalczyka i cztery z sekwencją mtDNA człowieka współczesnego. Dopiero wtedy uznaliśmy, że nasz oryginalny wynik zdał pierwszy test na wiarygodność.

Na kolejnym etapie Matthias rozpoczął wydłużanie odczytanej sekwencji. Wybrał startery umożliwiające namnożenie w PCR fragmentu mtDNA częściowo nachodzącego na pierwotny odcinek 61 nukleotydów (ilustracja 1.2). Okazało się, że także nowo odczytany ciąg różni się w niektórych pozycjach od wszystkich znanych sekwencji ludzi współczesnych. Przez kilka następnych miesięcy Matthias namnożył 13 nowych fragmentów DNA różnej długości, każdy przynajmniej dwukrotnie. Ich prawidłowy odczyt utrudniał fakt, że w DNA mogą się znaleźć przypadkowe mutacje powstałe na przykład wskutek kontaktu z niektórymi związkami chemicznymi, błędów w samym sekwencjonowaniu, a nawet – co wprawdzie zdarza się bardzo rzadko – występowania w obrębie tej samej komórki więcej niż jednej wersji mtDNA. Między innymi z tego powodu przyjęliśmy taktykę postępowania, którą już wcześniej przetestowałem, badając zwierzęce DNA (ilustracja 1.2). Zaczęliśmy od stworzenia sekwencji konsensusowej (składającej się z nukleotydów statystycznie najczęściej pojawiających się w danym miejscu). Dla każdego odczytanego nukleotydu (A, T, G lub C) za konsensusowy uznawaliśmy ten, który powtarzał się w konkretnej pozycji podczas kilku odczytów. Jego identyfikację staraliśmy się potwierdzić przynajmniej w dwóch niezależnych eksperymentach, ponieważ w skrajnym przypadku matrycą dla PCR mogła być jedna nić helisy, co by znaczyło, że wskutek przypadkowego błędu w pierwszym cyklu wszystkie klony bakteryjne niosłyby plazmid ze wstawką z tym samym błędem. Jeśli dwie próby PCR mające potwierdzić dany wynik wykazywały różnicę gdziekolwiek w odczytywanym fragmencie, przeprowadzaliśmy trzecią, by rozstrzygnąć, który z wyników jest powtarzalny. Matthias wykorzystał łącznie 123 sklonowane fragmenty DNA i złożył ostatecznie odcinek najbardziej zmiennego ewolucyjnie fragmentu mtDNA liczący 379 nukleotydów. Jeśli się nie myliliśmy, a przyjęte przez nas kryteria były właściwe, mieliśmy do czynienia z sekwencją neandertalskiego mtDNA. Teraz mogliśmy już przystąpić do najprzyjemniejszej i najbardziej fascynującej części naszej pracy – porównań starożytnego DNA ze współczesnym.

CIĄG DALSZY DOSTĘPNY W PEŁNEJ, PŁATNEJ WERSJI

1 Ang. polymerase chain reaction. Ten i inne przypisy oznaczone gwiazdką pochodzą od tłumacza.

2 Ang. ancient DNA, aDNA, nazywane jest także antycznym lub kopalnym DNA.

3 Standardowy środek odkażający stosowany w laboratoriach, skuteczny i tani.

PEŁNY SPIS TREŚCI:

Przedmowa

Rozdział 1. Neandertalczyk ex machina

Rozdział 2. Mumie od podszewki

Rozdział 3. Ślady przeszłości

Rozdział 4. Dinozaury w laboratorium

Rozdział 5. Nic, co ludzkie…

Rozdział 6. Chorwacki łącznik

Rozdział 7. Nowy dom

Rozdział 8. Hipotezy i teorie

Rozdział 9. Próby jądrowe

Rozdział 10. Nowe rozdanie

Rozdział 11. Kości zostały rzucone

Rozdział 12. Twardy orzech do zgryzienia

Rozdział 13. Diabeł tkwi w szczegółach

Rozdział 14. Mapowanie genomu

Rozdział 15. Genom z kości odczytany

Rozdział 16. Przepływ genów?

Rozdział 17. Pierwsze wnioski

Rozdział 18. Przepływ genów!

Rozdział 19. Druga fala

Rozdział 20. Esencja człowieczeństwa?

Rozdział 21. Publikujemy genom

Rozdział 22. Wyjątkowo niezwykły palec

Rozdział 23. Krewny neandertalczyka

Posłowie